案例摘要：赣南医科大学药学院胡海波教授团队在 Frontiers in Plant Science 发表研究，采用轨道阱-离子阱质谱（UHPLC-HRMS-MS）结合计算机辅助结构解析方法，对客家传统草药山蜡梅（Chimonanthus grammatus）的代谢物进行系统表征：共鉴定 83 个化合物（含 39 个化合物的 17 种异构体）及其裂解规律，并通过活性导向分离得到 9 个抗菌成分。研究联合 MS Workbook Suite（含 MS Fragmenter 模块）与 ChromGenius 完成数据库检索、碎片预测与保留时间预测，在区分结构相似的同分异构体方面展现出明显优势。
山蜡梅（Chimonanthus grammatus M.C. Liu）为蜡梅科客家传统草药，目前仅分布于中国江西赣州地区。当地客家人栽培该植物数十年，用作治疗风寒感冒、咳嗽及风湿性关节炎的民间草药[1,2]；传统习惯中还将嫩枝叶投入鱼塘以预防鱼类感染[3]，提示该植物可能具有抗菌活性及相关化合物。
蜡梅属植物已被开发为多种成药，如「山蜡梅颗粒」（用于风热感冒、发热咽痛）、「蜡梅油」（用于皮肤溃疡、湿疹肿痛）等。该属植物仅分布于中国南方，已分离出生物碱、倍半萜、香豆素、黄酮、有机酸等百余种化合物[5–11]，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种活性[12–16]。但部分物种（如 C. praecox）对动物具有肾毒性，可能与所含生物碱有关。
目前对山蜡梅的研究较少，仅见遗传多样性、精油活性及少量非挥发性成分报道[17–24]，其化学成分谱与抗菌物质基础尚未系统阐明。因此，本研究通过 UHPLC-HRMS-MS 分析化学成分、广谱抗菌活性筛选及活性导向分离鉴定主要抗菌成分，并对活性组分与高含量化合物进行 IC50、最小杀菌浓度（MBC）及抗生物膜活性测定，以评估其药用潜力。
随机取提取物样品，以甲醇溶解配制 0.1 mg/mL 溶液，进样前稀释 20 倍，每次进样 5 μL。采用 Ultimate 3000 超高效液相色谱系统耦合 Orbitrap Elite 超高分辨质谱仪进行检测。
全扫描范围 m/z 100–1500，选择前体离子强度最高的 10 个离子进行二级碎裂（dd-MS²-TOP 10），碎裂范围 m/z 100–1500。质谱数据通过 Xcalibur 4.2、Freestyle™ 1.5、MS Workbook Suite 2021（含 MS Fragmenter 模块）及 ChromGenius 软件进行分析。
通过 MS Workbook Suite 软件将山蜡梅提取物的质谱数据与自建数据库进行自动匹配，基于匹配离子提取总离子流图（TIC）。研究共鉴定出 83 个成分，包括 21 个萜类、20 个香豆素类、19 个黄酮类、15 个有机酸类、4 个生物碱类、2 个苷类、1 个蒽醌类及 1 个甾体类化合物。
根据峰面积比较，5,6,7-三甲氧基香豆素和山奈酚的相对含量最高（分别为 23% 和 19%），其他含量超过 2% 的主要成分包括 E-4-(4,8-二甲基壬-3,7-二烯基)呋喃-2(5H)-酮、东莨菪内酯、烟花苷、滨蒿内酯、槲皮苷、槲皮素、异秦皮啶、秦皮乙素、木犀草素等。本研究首次通过质谱技术系统报道了山蜡梅非挥发性成分的化学谱图，并阐明大多数化合物的裂解规律。
化学成分鉴定分步骤进行：首先利用 MS Workbook Suite 自动提取前体离子，随后在 COCONUT 天然产物数据库及自建蜡梅属植物数据库中进行超高分辨质谱检索。自建数据库收录了既往从蜡梅属植物中分离鉴定的化合物，为准确鉴定提供了最优依据。最终从山蜡梅提取物中鉴定出 83 个成分，包括 39 个化合物的 17 种异构体。
以质荷比 303.0499 [M+H]⁺ 和 301.0350 [M−H]⁻ 的前体离子为例，提取物中在保留时间 12.997、13.330、13.902 和 15.840 分钟处出现 4 个色谱峰，其质量数符合化学式 C15H10O7 或 C15H11O7⁺。数据库检索共发现 55 个异构体，其中仅槲皮素曾有蜡梅属植物报道[27]。四个异构体的二级质谱碎片高度相似，提示属于同一化学结构类型。
通过公共数据库比对实验 MS² 谱图，并对无标准谱图的化合物采用 MS Fragmenter 预测其裂解规律。以槲皮素为例，MS Fragmenter 指认了关键碎片峰：m/z 257 (C14H11O6⁺)、229 (C13H9O4⁺)、165 (C8H5O4⁺)、137 (C7H5O3⁺)、285 (C15H9O6⁺) 等。
为区分结构相似的异构体，进一步采用 ChromGenius 进行保留时间预测：四个化合物分属异黄酮与黄酮两类母核，羟基取代位点不同导致极性差异[28]。对 55 个异构体在相同色谱条件下进行保留时间计算，回归方程为 0.03 × tR² + 1.936 × tR − 6.696。最终四个异构体的保留因子 k′ 值分别为 24.228、25.569、26.744、29.371，结构相似系数（Sim Coeff）分别为 0.794、0.785、0.790、0.790——Sim Coeff 越接近 1 表明计算可靠性越高，证明四个异构体的鉴定结果可信。最终鉴定四个成分为：2′,4′,5,7,8-五羟基异黄酮（IS1）、3-(3,4-二羟基苯基)-2,6,8-三羟基-4H-色烯-4-酮（IS2）、melanoxetin 和槲皮素。
为验证方法可靠性[29,30]，在相同条件下测定槲皮素对照品，通过保留时间与裂解谱图比对，确认了预测结果的准确性。研究还对另外 16 组异构体进行了类似分析。尽管质谱结合计算机辅助方法可有效区分大多数异构体，仍有 2 类结构高度相似的异构体（m/z 347.2230 的 calycanthine 类双聚生物碱与 m/z 443.0973 的双异秦皮啶类）需通过核磁共振鉴定纯品后才能确认。
关于方法局限性：碎片模式的可靠性易受仪器类型、解离技术、电离模式、碰撞能量等实验因素影响。但研究表明，碎片机理在不同仪器间具有高度重现性[35,36]，基于预测碎片进行比对具备可行性[37]。若仅依赖 MS Fragmenter 的评分排名，碎片预测对化合物鉴定的可靠性仍不足[38]；为此，本研究联合使用 ChromGenius 计算所有候选化合物的保留时间，最终综合碎片匹配度与保留时间吻合度共同确定鉴定结果。
采用四种不同极性溶剂（水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷）对山蜡梅茎叶粉末进行提取，检测其对 21 种微生物的抗菌活性。结果显示，山蜡梅提取物对 3 种革兰阳性菌（G⁺）和 4 种革兰阴性菌（G⁻）具有显著抑制效果（抑制率 IV > 50%），IC50 均低于 1 mg/mL。
鉴于甲醇和乙酸乙酯提取物具有广谱且高效的抑制活性，研究后续采用这两种溶剂进行活性导向分离，以鉴定其活性成分。
从 6.4 g 山蜡梅粗提物出发，经正相硅胶柱层析分离为 242 个流分。对各流分进行多菌种抑制活性测试，筛选出 8 个活性最强的流分（F30、38、45、52、59、130、138、200）进行后续纯化。经半制备反相 C18 柱高效液相色谱分离，每个 HPLC 运行收集 80 个子流分，并选取金黄色葡萄球菌（G⁺ 代表）、大肠杆菌（G⁻ 代表）与白色念珠菌（真菌代表）进行活性测试，对应色谱图中的特征峰。收集活性峰复测验证后，通过 UHPLC-HRMS-MS 进行化学鉴定。
质谱在正、负离子模式下分析显示，13 个活性峰对应 9 个已知化合物：霍马洛烯醇 C (1)、异秦皮啶 (40)、4-羟基-1,10-开环卡达-5-烯-1,10-二酮 (67)、豆甾-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇 (53)、山奈酚 (68)、E-4-(4,8-二甲基壬-3,7-二烯基)呋喃-2(5H)-酮 (79)、槲皮苷 (47)、茉莉酸 (31) 和槲皮素 (62)。这些化合物均曾在蜡梅属植物中分离得到，进一步佐证了鉴定结果。所有 9 个化合物均对金黄色葡萄球菌有抑制作用；化合物 40、68 和 62 对大肠杆菌有活性；仅化合物 31 对白色念珠菌有抑制效果。
异秦皮啶 (40)、槲皮苷 (47) 与山奈酚 (68) 对浮游态金黄色葡萄球菌表现出显著抑制活性，IC50 分别为 13.51、15.86 和 18.08 µg/mL（槲皮素亦为 15.86 µg/mL）。
更为重要的是，三种黄酮类化合物表现出显著的双相抗生物膜活性：抑制生物膜形成方面，BIC50 分别为 15.43、18.86 和 17.31 µg/mL；清除已形成生物膜方面，BEC50 分别为 45.86、≥62.50 和 57.62 µg/mL——抑制与清除活性均优于对照药物环丙沙星。该特性对治疗耐药性金黄色葡萄球菌感染具有重要价值。
本研究系统阐明了山蜡梅的抗菌物质基础及其作用特性：
凯美科提示：MS Workbook Suite（含 MS Fragmenter）与 ChromGenius 可协同完成质谱数据的数据库检索、碎片预测与保留时间预测，应对复杂天然产物提取物中同分异构体区分等鉴定难题。如您所在团队有代谢物鉴定与质谱数据分析需求，欢迎与我们联系，了解软件产品方案与技术合作。
