活性导向与分子网络策略从贯叶连翘中发现 PPAP 类衍生物

钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是一种高发性瓣膜病变，已成为全球心血管疾病发病的第三大诱因^[1,2]。该病在70岁以上人群中的患病率约为2%，全球每年约导致1260万新增病例^[3,4]。CAVD的发病机制涉及多因素参与的渐进性进程，其特征为瓣膜内皮细胞、间质细胞与免疫细胞间复杂的相互作用，最终驱动主动脉瓣叶结构重塑及疾病进展^[5,6]。尽管临床与基础研究已取得长足进展，CAVD发生与发展的分子机制尚未完全阐明。目前尚无获批药物可有效延缓或阻断其病程，外科主动脉瓣置换术仍是唯一有效的治疗手段^[5,7,8]。这一现状凸显了开发能够减轻或逆转瓣膜钙化的新型治疗药物的迫切性。

基于本课题组对金丝桃属植物生物活性天然产物的持续研究^[9-11]，我们采用生物活性导向筛选与分子网络分析联用策略，对贯叶连翘（H. monogynum）进行系统研究，从中分离得到结构新颖的双开环多环多异戊烯基化间苯三酚（PPAP）类化合物——hypermonane A（HMA, 1）。该化合物具有前所未有的3/6-5/6/5五环骨架，并同时获得4个已知生物合成类似物（2–5）。本文报道了这些化合物的分离纯化、结构鉴定与生物活性评价（图1）。

图1. 化合物1–5的化学结构

贯叶连翘（H. monogum）的95%乙醇提取物残渣悬浮于水，依次用石油醚（PE）进行分配萃取。对石油醚萃取部位进行硅胶柱层析，得到六个主要组分（Fr. A–Fr. F）。

为评估其潜在抗钙化活性，我们首先检测了人主动脉瓣组织中成骨关键转录因子RUNX2的表达水平。Western blot结果显示，与健康对照组（健康组n=18；CAVD组n=24）相比，CAVD样本中RUNX2表达显著上调（图2A、B）。对照组主动脉瓣样本取自接受心脏移植的扩张型心肌病患者，经超声心动图确认无钙化；钙化组样本来自因CAVD接受主动脉瓣置换术的患者，排除风湿性心脏病、感染性心内膜炎或二叶式主动脉瓣病例。此外，在成骨培养基（OM）处理的人瓣膜间质细胞（hVICs）中观察到RUNX2表达呈时间依赖性升高（图2C、D），表明钙化表型诱导成功。

基于自主研发的高通量筛选平台，我们通过检测OM诱导的hVICs中RUNX2蛋白水平评估各组分的抗钙化潜力^[11-16]。结果显示，Fr. E在所有组分中抑制活性最为显著，故进一步分离获得七个子组分（Fr. E1–Fr. E7）。筛选发现Fr. E6对OM诱导的钙化抑制效果最强（图2E）。通过活性导向分离，最终从Fr. E6中鉴定出5个PPAP类化合物，包括1个具有新颖3/6-5/6/5五环骨架的新化合物（1）及4个已知生物合成类似物（2–5）。对包含上述化合物的分子网络簇进行扩展分析，各节点按其母离子m/z值标注（图2F、G）。

图2. 生物活性与分子网络导向的发现策略构建

通过¹³C核磁共振（NMR）及高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）数据（m/z 497.2508 [M+Na]⁺，C₂₇H₃₈O₇Na⁺理论值497.2515），确定HMA (1)的分子式为C₂₇H₃₈O₇，不饱和度为9。¹H NMR谱（表S1）显示一组仲丁基信号（δ_H3.11, m; 1.08, d, J=7.2 Hz; 1.72, m; 1.34, m; 0.85, t, J=7.2 Hz）及五个甲基单峰。¹³C NMR及无畸变极化转移增强（DEPT）谱（表S1）共显示27个碳信号，包括7个甲基、6个亚甲基、4个次甲基和10个季碳。

综合二维核磁分析表明，HMA属于PPAP衍生物，包含两个特征结构单元（单元A与B，图3A）。¹H-¹H COSY谱揭示三组独立自旋系统：H₃-25/H-24/H₂-26/H₃-27、H₂-18/H-19、H₂-7/H-8/H-12/H₂-11/H₂-10（图3A）。通过关键HMBC相关信号解析单元A结构：H₃-17与C-1/C-6/C-18相关，H₃-21/H₃-22与C-2/C-19相关，H-19与C-6相关，H₂-18与C-1/C-2相关（图3A）。单元B通过H₃-15与C-8/C-9/C-10、H₃-16与C-12/C-13/C-14的HMBC相关确定。单元间连接通过H₃-17（单元A）、H₂-7（单元B）和H₂-14（单元B）与羰基碳（C-5）的HMBC相关确立。

由于NMR数据中缺失关键相关信号，2-甲基丁酰基与结构片段A、B的连接位点无法直接确定。但基于以下两点：（1）C-2是分子骨架中唯一未被取代的位点；（2）PPAP类化合物中C-2位2-甲基丁酰基取代的普遍性，暂将该酰基定位于单元A的C-2位。通过ACD/Structure Elucidator 软件计算分析（图3B）^[17–19]最终确认化合物1的平面结构，所提出的生物合成途径（图3C）进一步支持其合理性。

通过旋转坐标系Overhauser效应谱（ROESY）数据分析（图3A），确定了化合物1的相对构型。H-19与H₃-17之间存在关键相关信号，表明二者空间邻近且位于分子同一侧（暂定为α取向）。该立体化学指认进一步提示C-2位的异戊酰基为α取向，而环丙烷部分为β取向。其余ROESY相关信号（H-8/H-7β、H-7β/H₃-15、H-12/H-7α、H-12/H₃-16）表明H-8与H₃-15位于同一侧，而H-12与H₃-16位于相反侧。

由于C-6羰基邻位键旋转受阻且未检测到多重构象NMR信号，化合物1被推断为阻转异构体^{[20, 21]}。对两种可能阻转异构形式（1与1a）进行结构建模，发现仅2R,4S,6S,8S,9R,12R,13S,19R,M构型（1）与ROESY相关峰（尤其是H-7β与H-18β的空间邻近）吻合（图3D）。为进一步验证相对立体化学，采用规范不变原子轨道（GIAO）法计算四种候选非对映异构体（1a–1d）的¹³C NMR化学位移，通过DP4+方法进行统计分析（图3E和图S1），结果支持所提构型^[22]。基于含时密度泛函理论（TDDFT）的电子圆二色谱（ECD）计算显示实验与理论曲线高度一致（图3F），最终确认绝对构型。

通过文献对比，鉴定已知化合物为chipericumin C (2)^[23]、chipericumin D (3)^[23]、monosescinol B (4)^[24]和monosescinol C (5)^[24]。

化合物1（HMA）可显著下调成骨标志物RUNX2和碱性磷酸酶（ALP）表达，并缓解人瓣膜间质细胞（hVICs）钙化。在成骨培养基（OM）条件下，HMA（5–80 μmol/L）浓度梯度可调控RUNX2和ALP表达（图4A–C）。CCK-8活性实验测定HMA对hVICs的半抑制浓度（IC₅₀）为147.7 μmol/L（图4D）。在延长成骨培养中，HMA表现出抗钙化效应：7天OM培养后，HMA处理组ALP活性显著降低（图4E–F）；21天成骨诱导后，茜素红染色显示钙沉积明显减少（图4G–H）。

为阐明化合物HMA缓解人瓣膜间质细胞（hVICs）钙化的作用机制，本研究开展了网络药理学分析（图5A、B）及RNA测序（图5C）。通过Comparative Toxicogenomics Database（CTD）和GeneCards数据库筛选，共获得76个HMA相关靶点基因与534个CAVD相关靶点基因（图5A）。进一步交叉比对发现65个重叠靶点（图5B）。在成骨培养基（OM）诱导的hVICs转录组分析中，发现钙化相关信号通路显著紊乱。

火山图显示关键差异表达基因，包括平滑肌肌动蛋白α2（ACTA2）（OM组较对照组上调；OM+HMA组较OM组下调）（图5D、E）。对上调基因的比较分析表明，HMA特异性抑制细胞外基质（ECM）重塑相关基因（I型胶原α1链COL1A1、含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶ADAMTS4）及成骨相关基因（碱性磷酸酶ALP、扭转相关蛋白TWIST2）（图5F、G）。功能富集分析（图5H、I）进一步证实HMA通过显著抑制ECM组织、细胞应激反应及硫化合物代谢等关键生物学过程，延缓CAVD进展。

实时荧光定量PCR（qPCR）验证显示，在成骨条件下HMA处理可显著降低hVICs中ADAMTS4、TWIST2和COL1A1等钙化相关基因的mRNA表达水平（图S2A–C）。分子对接分析表明，HMA与核心转录因子RUNX2和TWIST2具有强结合亲和力，对接打分分别为-6.6和-6.9 kcal/mol（图S2D、E），提示其可能通过直接作用于转录因子发挥抑制活性。

通过导丝损伤模型快速模拟CAVD的核心病理特征（炎症-纤维化-钙化级联反应），为研究植物药成分抗主动脉瓣钙化的分子机制提供可靠平台^[13,15]。为评估HMA的体内疗效，建立导丝损伤诱导的小鼠CAVD模型，随机分为两组：HMA治疗组（20 mg/kg，每72小时腹腔注射，持续6周，n=8）和溶剂对照组（等量生理盐水，n=8）。所有动物实验获武汉食品药品安全评价中心动物伦理委员会批准（批件号：202410342）。

治疗后评估显示（图4I），与对照组相比，HMA治疗组小鼠心功能显著改善，跨瓣峰值压差和平均压差等血流动力学参数明显降低（图4J-L）。茜素红染色证实HMA治疗组主动脉瓣钙化程度显著减轻（图4M-O）。结果表明，HMA通过改善血流动力学障碍和抑制病理性钙化延缓CAVD进展，展现治疗潜力。

本研究采用活性与分子网络导向策略，从贯叶连翘中发现具有新颖C-1/C-2、C-2/C-3双开环结构的PPAP衍生物HMA，其独特的3/6-5/6/5五环骨架通过ACD/Structure Elucidator的计算机辅助结构解析（CASE）、GIAO核磁计算及ECD计算确定了绝对构型。在CAVD模型中，HMA通过双重抑制成骨分化（RUNX2/ALP）和细胞外基质重构（COL1A1/ADAMTS4）发挥抗钙化活性。导丝损伤小鼠模型进一步验证其减轻瓣膜钙化的功效。结构-活性关系表明，间苯三酚核心的双开环结构及其生成的内酯环是其抗钙化活性的关键药效团。

与临床阶段策略相比，HMA具有双重抑制优势：不同于双膦酸盐类药物（抑制羟基磷灰石沉积）或NOTCH通路靶向药（单信号轴调控），HMA能同步阻断成骨分化和ECM病理性重构两个CAVD进展关键驱动环节，可能产生更全面的治疗效应。因此，HMA有望成为CAVD治疗领域首个first-in-class小分子抑制剂，填补手术置换之外的治疗空白。后续研究将聚焦药代动力学优化及与抗炎药的协同效应评估。