文献分享｜利用 CASE 解决“难以破译”的化学结构

01

过去的二十年中，分子结构解析的新方法发展惊人，一维特别是二维核磁谱是我们从分析数据中获取化学结构信息的主要来源。即使没有一维¹³C光谱，也能从二维光谱（如HSQC和HMBC光谱）中提取化学位移。然而，从实验光谱中明确解析出单一分子结构往往困难重重。二维核磁共振数据常具模糊性，存在交叉峰重叠、非标准相关、数据不完整、强峰与中强相关峰信息矛盾等问题。通过新的二维核磁共振实验方法的不断开发，例如H2BC、1,1-ADEQUATE、1,n-ADEQUATE以及HSQC-TOCSY等技术的应用，某些相关核之间拓扑距离的不确定性可以被消除，并直接提升解析未知化合物结构的能力。

与此同时，计算机辅助结构解析新方法也取得了进展。从20世纪60年代末发表的开创性研究以来，研究人员已开发出多代CASE专家系统。CASE系统是强大的分析工具，能够辅助解析极其复杂的分子结构。这些系统充分模拟了光谱学家的系统化推理过程，但在逻辑组合推理方面远超人类专家。结构解析过程中使用的所有假设均可视为一组 “规则”。CASE系统从这组 “规则” 中推导出所有逻辑推论（结构），无一遗漏。推论（结构）的数量是有限的，因为与某一分子式相对应的异构体数量是有限的。从枚举的结构中选择最可能的结构可通过NMR化学位移预测方法实现。多年来CASE系统应用中积累的经验表明，CASE方法可显著加快结构解析进程，提高结构解析的可靠性，从而为研究人员节省大量时间。最终，CASE系统应被视为支持光谱学家的协同工具。它们还不太可能完全取代专家，因为在某些情况下，现有算法肯定无法超越人类的智慧和专业知识。其能力和局限性已在其他文献中详细综述。需要注意的是，二维核磁共振光谱的处理，尤其是¹H和X核（尤其是¹³C）峰位移的提取，可能是一个非常耗时的过程。在许多情况下，从数据中提取位移可能是使用CASE系统解决问题中消耗的绝大部分时间。

在本文中，我们试图表明，现代CASE专家系统应被视为光谱学家快速可靠解析分子结构的必备工具。我们将探讨两个从一维和二维核磁共振数据解析结构的案例，在这些案例中，经验丰富的光谱学家面临着无法克服的困难。通过诸多使用CASE方法解决这些问题的经历使我们能够断言，当今如果不结合专为处理从二维核磁共振光谱获得的模糊、不完整和矛盾信息而开发的专家系统，就无法客观评估这些新核磁共振实验技术的能力。

02

Kummerlöwe及其同事研究了含叠氮基的1,5 - 烯炔在亲电碘源存在下反应生成的一种产物^[2]。最初，研究人员尝试使用此类情况中常用的经典方法解析该新化合物的结构。高分辨质谱明确给出了未知物的分子式：C₁₆H₁₈NI，质荷比m/z=351.0486（计算值为C₁₆H₁₈NI的M+为351.0484）。研究第一阶段获取了以下光谱数据：红外光谱、一维¹H和¹³C光谱，以及二维COSY、HSQC、¹H-¹³C HMBC和¹H-¹5N HMBC实验数据。从数据中鉴定出11个结构片段：一个苯基、一个甲基、五个亚甲基（三个形成孤立链）、一个叔氮原子、一个碘原子和四个季碳原子。¹H-¹³C HMBC光谱显示63个远程相关，¹H-¹5N HMBC光谱显示七个交叉峰，这表明几乎每个片段都与其他片段相关，说明分子结构非常紧凑。由于难以从这些数据推导结构，研究人员还在配备5 mm低温TXI探头（优化质子检测）的布鲁克Avance 900 MHz光谱仪上记录了二维1,1-ADEQUATE光谱。1,1-ADEQUATE数据明确鉴定了相邻的季碳原子。尽管这是有用的信息，但这些额外数据仍无法帮助他们解析该分子结构。

由于经典核磁共振分析失败，作者决定尝试使用剩余偶极耦合(RDCs)这一非常规方法解决问题。根据RDC相关方法，他们假设只要能测量足够的各向异性参数并构建足够多的结构模型，就有可能确定正确的化学结构。为测量RDC，将化合物排列在拉伸的聚苯乙烯 / 氯仿凝胶中，并在氯仿溶液样品中测量相应的标量耦合。使用实验数据测试了14个结构，包括他们认为可能和不太可能的结构（见图1）。RDC数据分析表明，结构#2a是正确的。

为确认RDC数据提出的结构，他们合成了近100 mg反应产物，并使用光谱仪耗时3天采集了二维INADEQUATE光谱。INADEQUATE数据明确证实了通过RDC数据解析的结构#2a。此外，他们还用 ¹5N - 叠氮标记的反应原料，并测量¹5N标记化合物的¹³C-¹5N 耦合。这两项额外实验均明确支持结构 #2a。

后续数据分析表明，¹H-¹³C HMBC光谱中包含九个 “非标准” 相关（NSCs，即 nJHC, n>3）。考虑到该分子是高度刚性的体系，这并不奇怪。CASE程序通过解析可用的¹H-¹H和¹H-¹³C相关组合来推导碳 - 碳连接，并产生九个非标准的C-C连接（见图2），这是传统方法无法解析结构的主要原因。由于非标准连接的存在，用于从HMBC数据解析结构的初始 “规则” 系统变得极其矛盾。此外，在¹H-¹³C HMBC光谱中发现两个意外的强5JCH交叉峰——δ 46.2 ppm的两个质子与苯基的邻位碳相关联(见图2)。局部HMBC如图3所示，取自Kummerlöwe等人论文的支持信息。我们认为，这可能是由于碘原子体积较大导致苯基旋转受阻所致。

与此同时，作者发现结构#2a几乎肯定被排除在潜在结构之外，因为ChemDraw预测的¹³C化学位移与实验数据存在显著差异（见图4，其中显示了神经网络算法的结果用于比较）。平均误差为4.65 ppm，线性回归R2=0.982，这的确暗示结构#2a存在疑问。

图2. 结构#2a。箭头指示非标准的¹H-¹³C HMBC相关。虚线标记的46.2与128.0之间的连接对应于⁵J_CH。

图3.¹H-¹³C HMBC的局部放大图，显示C9H₂ (3.12 ppm) 和C10H₂ (3.26 ppm) 与苯基邻位的碳原子(128.0 ppm)之间异常强烈的信号（经Wiley-VCH许可使用）

图4. 采用神经网络算法（三角形）和ChemDraw内置算法（正方形）计算得到的¹³C化学位移与实验值的回归图。框中第一个数值为实验位移，第二个数值为ChemDraw程序的计算位移。

二维核磁共振数据的高度复杂性让研究者们认为，传统方法无法解决这一结构解析问题。做出这一判断时，他们仅对核磁共振数据进行了孤立分析，却未借助算法辅助手段——例如加拿大ACD/Labs公司开发的Structure Elucidator等计算机辅助结构解析（CASE）软件所提供的方法。该软件包已应用十余年，成功解决了众多实际问题。因此，研究团队利用该软件对文献中的实验数据展开分析，并测试了多种问题解决模式。

第一轮分析：将分子式、一维¹³C谱、HSQC 谱、¹H-¹³C HMBC谱及¹H-¹5N HMBC谱输入程序。为减少可能存在的非标准相关（NSCs）数量，首轮分析忽略了文献中标记为 “极弱” 的全部5个HMBC峰。程序自动生成了分子连接图（MCD），如图5所示。

图5. 分子连接图（MCD）。程序指定的原子杂化类型通过以下颜色标记：sp³——蓝色；sp²——紫色；非sp杂化——棕色（94.6）。标记 “fb” 表示禁止与相邻杂原子相连。请注意，季碳原子C (94.6) 被标记为非sp杂化，其杂化类型可以是sp²或sp³。

通过对分子连接图的逻辑分析，程序自动检测到 HMBC谱中存在非标准相关，这表明必须采用一种被称为 “模糊结构生成”（FSG）的方法。需要说明的是，FSG模式可自由调整远程相关的长度，且调整范围不受限制。运行FSG时做出的假设是：HMBC数据中包含数量未知的非标准相关，且每个非标准相关的长度也未知。

 仅利用这些数据，而没有进行人工干预。通过ACD/SES软件的结构生成器以及光谱和结构过滤器，软件在13分钟内输出了3种可能的结构。利用 Structure Elucidator中集成的神经网络算法对这些结构的¹³C和¹H化学位移进行了预测，随后按照其¹³C预测化学位移与实际化学位移平均偏差从小到大的顺序对结构文件进行了排序（图 6）。尽管在对结构进行排序时，¹H NMR预测通常被视为 “较弱” 的依据，但在本案例中，它被证明在为结构提供额外确认方面具有价值。

图6. 按¹³C化学位移平均偏差升序排列的输出结构表。

图6显示，正确的结构#2a被确定为最可能的结构，其¹³C偏差明显小于使用ChemDraw计算得出的偏差（另见图4）。预测算法对结构#1（如图6所示）给出的化学位移归属与作者提出的完全一致。生成的候选结构#2b（即图6中的#2）基于化学位移预测结果被排除。结构#3是根据实验数据经逻辑推理得出的，但由于其化学位移偏差较大而可被排除。

第二轮分析：使用了所有HMBC相关信号，未排除任何信号，包括9个非标准相关（NSCs），并将1,1-ADEQUATE相关信号也添加到二维核磁共振数据中（见图7中的分子连接图(MCD)）。

运行模糊结构生成（FSG）后得到如下结果：在 0.7秒内仅生成了一个正确的结构，即#1结构（图6）。因此，应用CASE方法使我们能够从HMBC和1,1-ADEQUATE数据中快速且明确地找到唯一正确的结构。已有多项研究表明，1,1-ADEQUATE数据与其他二维核磁共振数据相结合，是输入到CASE程序中的一组非常有价值的数据。

图7. 分子连接图。程序指定的原子杂化类型通过以下颜色标记：sp³——蓝色；sp²——紫色；非sp杂化 —— 棕色（94.6）。标记 “fb” 表示禁止与杂原子相邻。1,1-ADEQUATE相关用粗线条表示。

本文所回顾的第二个案例受到了Gross及其同事发表的文章的启发^[3]。他们提出了一种基于原子力显微镜（AFM）的小型平面分子结构测定新方法（作者在其文章中交替使用了AFM和SPM这两个术语，本文仅采用 AFM）。这种方法显然可作为有机结构分析中其他工具的优良补充，为验证其效用，他们研究了天然产物cephalandole A（化合物1，分子式 C₁₆H₁₀N₂O₂）—— 该化合物的结构先前曾被Wu 等人误判，后经Mason等人纠正 。

作者解释称，选择该化合物测试AFM方法是因为它符合前文所述的三个标准：重原子与质子的比例约为 2:1；1位的氧原子和4位的氮原子完全中断了碳骨架，将分子分为两部分；此外，C2位的羰基与最近的质子相隔4个键，在HMBC实验中预计不会显示相关信号，这些使该得结构的分析极具挑战性。分子式表明该结构不饱和度为13。

图8. 格罗斯(Gross)及其同事提出的cephalandole A 的可能结构。

作者利用¹H-¹³C HMBC和极为稀疏的COSY数据解析结构。基于NMR数据分析，他们提出了4个与现有数据相符的结构（见图 8）。作者指出，现有 NMR 数据无法区分吲哚亚结构是 2 位取代还是 3 位取代，因此这4个结构（#1-#4）均有可能。其中，结构#1是公认的cephalandole A结构，结构#2是该化合物先前被误判的结构。

Gross及其同事证实，将AFM方法与量子化学计算相结合，通过分子图像分析可筛选出结构#1为最可能的结构，这为光谱学家提供了一种新的独立工具，用于区分结构相似的平面分子。

我们将Gross及其同事提出的cephalandole A结构解析问题作为计算机辅助结构解析（CASE）专家系统的另一项挑战。将作者为分析该问题所获取的一维和二维NMR光谱输入至Structure Elucidator软件，并生成了分子连接图（MCD）。整个过程未进行任何用户干预或数据修正。对分子连接图的检查发现，二维NMR数据中存在非标准相关（NSCs），因此采用模糊结构生成（FSG）模式进行结构解析。结果，程序在1分50秒内生成了包含11个结构的输出文件；与前一示例相同，通过神经网络算法预测¹³C 和 ¹H NMR化学位移，筛选出结构#1作为最优候选结构。Wu等人最初提出的 “正确结构”（结构#2，图 8）也被生成，但在文件中排名第九，其¹³C化学位移偏差dₙ(¹³C) 为 3.70 ppm，因此必然被排除。我们在先前的综述中已表明，根据Structure Elucidator 计算的¹³C化学位移偏差，研究人员会立即排除该结构。图9展示了11个结构中的3个——它们具有相似的结构形态，分别排名第一、第四和第九。

本文的一位审稿人评论称，针对Gross等人提出的 “现有NMR数据无法区分吲哚亚结构是2位取代还是3位取代” 这一观点：若基于1,1-ADEQUATE数据筛选出结构#1和#2，1,n-ADEQUATE光谱中的³JCC相关可将结构#1中吲哚的2位与羰基连接，从而确定结构；相反，若基于1,1-ADEQUATE数据筛选出结构#3和#4，1,n-ADEQUATE光谱中的³JCC相关可将结构 #3 中吲哚的 3 位与羰基连接。因此，除CASE方法外，还有可行的光谱学方法可用于示例2的结构鉴定。另一种可能的结构鉴定方法是基于远程 ¹H-¹5N二维NMR：对于结构#1或#2，优化为～3 Hz 的¹H-¹5N HMBC光谱预计会显示与两个¹5N共振的相关信号。理想情况下，可开展这些额外的二维NMR实验，再将数据输入CASE程序，以进一步强力确认结构。

图9. 计算机辅助结构解析专家系统生成的输出文件中筛选出的结构，按¹³C化学位移预测结果分别排名第一、第四和第九。

值得注意的是，图8中提出的结构#3和#4完全未被生成。通过分析图9产生了一个疑问：由于CASE生成的结构#4比Wu等人提出的结构#9更优（图 9），且其几何构型与正确结构相似，那么AFM方法能否区分图9中所示的结构#1和#4？

03

本文讨论了两个被认为难以通过一维和二维核磁共振光谱的传统解析方法来解析的结构，两个案例中，研究人员均采用了新的、更具挑战性的实验技术来进行小分子结构解析。通过这些案例，我们试图证明，计算机辅助结构解析（CASE）方法可作为复杂且繁琐方法的一种可行替代方案，至少在这些案例中，它能够快速且可靠地解决这两个问题。正如Reynolds和 Enriquez^[4]所指出的，对常用脉冲序列实验的相关参数进行优化，也能够获取使用默认参数时无法得到的额外数据。

我们的结论是，现代CASE专家系统应被视为光谱学家快速且可靠地解析结构的必备工具之一。我们的研究表明，如今若脱离为二维核磁共振数据分析开发的数学算法，以及脱离从实验数据和附加信息中逻辑推断出所有相符结构的过程，就无法评估核磁共振实验技术的能力。我们相信，未来CASE软件将成为核磁共振光谱学家的常用工具，就像如今的软件已成为X射线晶体学不可或缺的一部分一样。

尽管本文证明了CASE方法可应用于现有数据，但我们并不反对开发新的、更完善的方法来生成新数据，以提高分子结构正确解析的成功率。特别是，Gross等人在单分子显微成像方面的研究令我们备受鼓舞，我们对这种方法的未来应用前景充满期待。