基于 CASE-DFT 的 Chlorodepsidones 结构解析及 Flavicansone 结构修订

基于计算机辅助结构解析 (CASE) 结合密度泛函理论 (DFT) 对来自印度尼西亚地衣浅黄枝衣 (Teloschistes flavicans) 的缺质子型卤代缩酚酸环醚类化合物的结构解析以及对Flavicansone的结构修正

印度尼西亚的生物探索计划致力于挖掘该国地衣植物的化学多样性，旨在发现具有显著生物活性的新化合物。通过对浅黄枝衣（Teloschistes flavicans）提取物的细致化学筛选分析，该物种被确定为优先研究对象。利用液相色谱-质谱联用技术（LC/MS）和核磁共振氢谱（¹H NMR）的去重分析，研究人员在地衣样本的叶状体中成功分离并鉴定了六种卤代缩酚酸环醚类化合物。其中三种新化合物：norflavicansone (1)、flavicansone (2) 和isocaloploicin (3) 的结构得到了快速解析，同时鉴定了已知的卤代缩酚酸环醚 (chlorodepsidones) 类化合物 (4−6)、stictic acid (7)、aurantiamide acetate (8) 和parietin (9)。通过结合计算机辅助结构解析（CASE）和密度泛函理论（DFT）计算的先进工作流程，研究人员对这些缺质子代谢物进行了结构解析。本研究采用了ACD/Structure Elucidator Suite这一先进的CASE专家系统，为解析复杂分子结构提供了高效、精确的方法。此外，研究还对先前报道的flavicansone结构进行了修正。新发现的三种分子属于杂合缩酚酸环醚，其结构特征在地衣缩酚酸环醚中较为罕见。

浅黄枝衣 (Teloschistes flavicans (Sw.) Norman)，隶属于黄枝衣科 (Teloschistaceae)，是一种广泛分布于热带至温带地区的灌木状地衣。先前的研究表明，该地衣含有蒽醌类化合物如parietin和/或teloschistin，以及其主要的卤代缩酚酸环醚类化合物 vicanicin。先前一项基于高效液相色谱-二极管阵列检测器 (HPLC-DAD) 的研究通过与标准品比较，区分了Teloschistes属不同物种中的多种化学类型，并鉴定了两种其他卤代缩酚酸环醚类化合物，即caloploicin和isofulgidin。

Vicanicin最早由Neelakantan于1962年从浅黄枝衣中分离并描述，并于1973年由Yosioka在从一种未确定的Caloplaca属物种中再次分离后进行了修订。在已描述的近40种卤代缩酚酸环醚类化合物中，一些与vicanicin密切相关的化合物已被分离出来，例如从Psoroma sphinctrinum中分离的norvicanicin，从Diploicia canescens中分离的4-O-methylvicanicin，以及从浅黄枝衣中分离的flavicansone。

尽管已有研究对印度尼西亚地衣的多样性进行了探索，但西苏门答腊地区丰富的地衣植物群在化学层面仍存在研究空白。为填补这一空白，研究人员在西苏门答腊采集了近15种地衣样本，并利用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术对其化学组成进行了系统分析。结果显示，浅黄枝衣在所研究的物种中表现出独特的化学特性，富含多种含卤次生代谢产物。基于这一发现，研究人员将浅黄枝衣作为进一步化学研究的重点对象。在后续研究中，研究人员成功分离并解析了六种卤代缩酚酸环醚类化合物（化合物1-6）的结构，其中三种为首次报道的新化合物。此外，还分离并鉴定出stictic acid（化合物7）、aurantiamide acetate（化合物8）和parietin（化合物9）。值得注意的是，flavicansone（化合物2）的结构在本研究中得到了进一步修正。通过结合计算机辅助结构解析（CASE）流程和密度泛函理论（DFT）计算，这些新的质子缺乏型多酚化合物的结构解析得到了可靠的验证，从而更好地甄别了CASE方法中排名靠前的结构。这一方法的应用显著提升了结构解析的可靠性和效率，为复杂天然产物的化学研究提供了新的技术范式。

首先，使用LC-MS技术对浅黄枝衣提取物的粗制丙酮溶液进行分析。通过初步检查得到的色谱图，发现了一系列与不同缩酚酸酮系列相符的含卤代谢产物。这一发现得益于地衣数据库质谱一级谱图 (LDB-MS1)，该数据库收集了迄今为止所报道的所有地衣代谢产物的质荷比 (m/z)。

利用该数据库，研究人员能够识别出与六个与卤代缩酚酸环醚类化合物相对应的常见信号。具体来说：

• 化合物1和4的信号与fulgoicin/scensidin/norvicanicin的分子式相匹配。

• 化合物2和5的信号与vicanicin/isovicanicin/flavicansone的分子式相匹配。

• 化合物3与caloploicin/dechloro-O-methyldiploicin的分子式相匹配。

• 化合物6的信号与4-O-methylvicanicin的分子式相匹配。

由于这些化合物在¹H NMR谱图中检测到的信号数量较少，因此可以基于与已知卤代缩酚酸环醚类化合物的结构的化学移位值差异，轻松细化这些初步鉴定（图1）。基于每个分子式的候选数量有限，我们假设其中一些化合物可能是新的，因此将分离工作重点放在这些代谢物上。

为了全面解析这些化合物的结构，我们系统采集了一整套二维核磁共振（2D NMR）分析数据，并完成了¹H和¹³C核磁共振化学位移的完整归属（表1）。在深入解析这些化合物的结构之前，值得强调的是，所研究的这些物质属于缺质子结构类别。根据克鲁斯规则（Crews Rule），如果一种化合物中质子数量与碳原子数量之比小于1，则从常见的二维核磁共振序列中获得的信息可能不足以提供明确的结构归属。对于高度取代的地衣卤代缩酚酸环醚类化合物，文献综述表明，其结构解析通常依赖于两种主要方法：一是通过X射线晶体学分析直接确定，二是通过与同时合成的目标化合物进行核磁共振数据对比来验证结构。然而，针对这类化合物的完整核磁共振光谱数据集在现有文献中较为稀缺。这种信息的缺失不仅增加了新类似物的描述难度，也使得结构解析过程更加复杂，导致对所提出的结构频繁进行修正。

化合物1分离得到时为无定形固体，其精确质量对应的分子式为C₁₇H₁₄Cl₂O₅，由高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）中检测到的m/z为367.0145 的 [M−H]− 信号推导得出的（分子式C₁₇H₁₃³⁵Cl₂O₅−计算值为367.0146）。文献中报道了三种具有此元素组成的地衣卤代缩酚酸环醚类化合物：fulgoicin、norvicanicin和scensidin。然而，化合物1的¹H NMR谱图与norvicanicin和scensidin的谱图均不相符，因为在¹H NMR 谱图中观察到的信号表明存在一个芳香质子、一个甲氧基和三个芳香甲基。虽然不同信号的性质可能与fulgoicin的结构相符（由于该化合物是通过合成来验证推断的结构的，因此文献中没有其NMR数据），但与第一个芳香体系相关的¹³C NMR化学位移值与同时分离得到的norvicanicin（4）和vicanicin（5）的A环非常相似（表 1），这表明化合物 1 的芳香 A 环应该具有类似的取代情况，这似乎与图 2A 中整合的关键2D NMR相关信息一致。因此，另一个苯环（B 环）应该对应一个高度取代的体系，该体系包含一个甲基、一个甲氧基、一个氯原子和一个芳香质子。从对 2D NMR 数据的分析中，只能推导出很少的结构限制条件来确定这些不同取代基在该子结构上的位置。在δH 6.93 处检测到的芳香质子与δH 3.91处的甲氧基之间存在核Overhauser效应（NOE）相关，这确定了这两个基团是相邻的。相反，在化学位移δH为2.55处检测到的芳香甲基与上述芳香质子或甲氧基之间不存在NOE相关，这表明该芳香甲基不在上述两个基团的旁边。

由于化合物1的NMR谱图中出现的信号数量稀少，仅依据光谱学证据似乎不可能明确确定各个取代基的位置。在这种情况下，为了区分各种存在的可能性，我们考虑了生物合成方面的因素。已知缩酚酸环醚 （depsidones） 的生物合成过程是从orsellinic acid和/或β-orcinol carboxylic acid开始的（详见下文，图 8）。基于这一点，我们能够提出化合物 1 的结构，如图 2A 所示。值得注意的是，该结构与所观察到的2D NMR相关信息并无任何严重冲突，且类似的B环取代模式已在isofulgidin中报告过，据称其来自同一种地衣，但文献中未找到其NMR数据。

尽管如图2A所示的化合物1的结构与该化合物的光谱数据完全相符，但由于其¹H NMR谱图中出现的共振信号数量稀少，要确保这些特征能唯一地确定所测定的结构则更加困难。为了确保与我们的NMR数据组相符的所有合理结构都已被详尽探究，我们又使用ACD/Structure Elucidator Suite软件，进行了CASE工作流程。

简而言之，该专家系统基于NMR和HRMS，将分子式、化学位移，以及来自于COSY、HSQC和HMBC谱的二维NMR视为一组结构限制条件，从而得出一系列同分异构的结构候选物。除了对所有可能的结构进行逻辑推导之外，要从所生成的不同分子中选出最有可能的候选结构，还需依靠HOSE 算法、神经网络法和增量法三种方法来预测它们的¹³C NMR化学位移。已有充分证据表明，在借助CASE工作流程，检测出多个可能的结构时，对其中排名靠前的结构开展DFT计算，能够显著提升结构选择过程的可靠性^[1] 。

软件利用化合物1的1D 和2D NMR 数据构建了一个分子连接图（MCD），该图包含了分子式中的所有原子以及它们之间的连接关系（图2B）。需要注意的是，在结构生成过程中，较弱HMBC相关峰有可能对应于非标准的异核多键相关（即⁴J HMBC相关）和标准异核多键相关关系（2-3个化学键长度），因此，原子核之间相互作用的距离被设置为2到4个化学键，以避免在此过程中遗漏正确的结构。

从上述分子连接图 (MCD) 出发，我们启动了ACD/Structure Elucidator Suite软件的模糊结构生成（Fuzzy Structure Generation）程序。该算法得出了以下结果：k = 69472→185→22，tg=8分50秒，其中k表示生成的结构数量，在这些结构中有185个通过了光谱和结构筛选，去除重复结构后还剩下22个结构，而tg则是计算时间。图3中排名前两位的结构似乎是仅有的值得进一步考量的候选结构，因为列表中的其他化合物存在结构上的不合理性，并且（或者）与光谱数据存在一定程度的差异。

令人欣喜的是，排名第一的结构与人工确定的结构一致。除了偏差最小之外，其DP4概率值在97.68%至99.99%之间，这有力地表明由CASE所提出的这个结构是正确的。为了进一步支持我们的结论，在B3LYP/6-31+G (d,p) 水平下优化几何结构的基础上，并在mPW1PW91/6-311+G (2d,p) 水平上，对排名前两位的候选结构进行了¹³C化学位移的DFT计算。密度泛函理论预测的化学位移的所有统计参数（均方根偏差（RMSD）、最大偏差（max_dev）以及相关系数（r））都明显支持计算机辅助结构解析所倾向的结构（表S2）。这种结合计算机辅助结构解析与密度泛函理论（CASE-DFT）的分析可靠地确定了如图2A所示的化合物1的结构，该化合物被命名为norflavicansone。

化合物2分离得到时为浅黄色无定形固体。根据HRESIMS中质荷比m/z为405.0267处的 [M + Na]+信号确定其分子式为C₁₈H₁₆Cl₂O₅（计算值C₁₈H₁₆³⁵Cl₂O₅Na+为405.0267）。化合物2的¹H NMR谱图与虽然与vicanicin或isovicanicin的结构明显不符，但却似乎与几年前从印度尼西亚浅黄枝衣样品中得到的flavicansone的结构相符（图 4A）。然而，化合物2的B环¹³C NMR化学位移与同时分离得到的norflavicansone（1）的B环化学位移高度吻合，这让我们推测这两种化合物的B环结构相似，因此与已报道的norflavicansone结构有所不同（图 4A）。此外，化合物2与A环相关的所有信号与共分离的4-O-methylvicanicin（6）中获得的那些信号非常一致，使我们能够为化合物2提出一个暂定的缩酚酸环醚结构，与其确定的分子式一致，这应对应于norflavicansone（1）的4-O-甲基化衍生物（图4A）。2D NMR数据与这个假设结构没有任何正式的不一致。

为了寻找独立的证据来有力支持化合物2已提出的结构，我们使用ACD/Structure Elucidator软件对化合物2的核磁共振光谱数据进行了分析，我们对所用的分子连接图做了轻微修改，如图 4B所示。这些修改是基于与之前已解析的化合物1的核磁共振数据集的相似性，修改内容包括表明化学位移在144.1到162.9 之间的六个碳原子必须与一个杂原子相连（标记为 “ob” 状态）。上述对分子连接图的修改加快了结构生成的过程。

对于CASE工作流程，模糊结构生成算法得出了以下结论：k = 39642→（结构筛选）→273→（去除重复结构）→117，计算时间tg=48秒。图5中整理了排名靠前的六个相似结构。 

同样，第一个结构对应于手动解析的结构。它具有最低的平均和最大化学位移偏差，并且在用于¹³C NMR化学位移预测的所有经验方法中，DP4参数接近100%（图S7）。然后对CASE工作流程中确定的两个排名靠前的候选结构在 B3LYP/6-31+ G (d,p) 水平下对几何结构进行优化，并在 mPW1PW91/6-311+ G (2d,p) 理论水平上进行了DFT计算，以预测其¹³C NMR化学位移。DFT预测的¹³C NMR化学位移明确地将排名第一的候选结构定义为最可能的结构（表S4）。

对Sanjaya等人在2020年发表的与flavicansone相关的光谱数据进行简要检查发现，其1D和2D NMR数据与化合物2的数据完全一致，这表明flavicansone可能具有与化合物2相同的结构。为了解决这个问题，我们决定将Sanjaya等人发表的NMR数据提交给CASE工作流程进行分析。令人十分惊讶的是，这篇论文正文中出现的关键HMBC相关信息与相关补充信息中所披露的 HMBC 谱图并不相符。将从flavicansone原始论文辅助信息中的光谱分析中获取的1D NMR化学位移和HMBC相关性输入Structure Elucidator，创建MCD并运行模糊结构生成模式，结果如下：k=7,321,832→（过滤）→17201→（去除重复项）→5902，计算时间tg=3小时22分钟。解决方案提供了一打作为排名靠前结构的候选缩酚酸环醚（见图S8）。最有可能的结构与本文中确定为化合物 2 的结构相对应，因此可以自信地将flavicansone的结构修订为此前未知的缩酚酸环醚结构，即化合物2的结构，如图4A所示。需要注意的是，最初分配给flavicansone的结构出现在第13位（见图S8），这将立即被CASE工作流程否定，因此它作为flavicansone的候选结构是不太可能的。值得注意的是，当我们根据Sanjaya等人论文正文中披露的HMBC相关性生成分子连接图并运行CASE工作流程时，输出结构中也保留了修订后的flavicansone结构，而之前分配给flavicansone的结构排名第七（图S9）。尽管如此，所有候选结构都存在令人担忧的化学位移偏差，这进一步证实了我们假设，即该论文正文中HMBC相关性可能存在错误表述。

化合物3分离得到时为无定形固体。负离子模式HRESIMS显示在m/z 400.9757处有信号，表明其分子式为C₁₇H₁₃Cl₃O₅（计算值为C₁₇H₁₃Cl₃O₅−，400.9756），这使得化合物3成为caloploicin和dechloro-O-methyldiploicin的同分异构体。化合物3的1H NMR数据与dechloro-O-methyldiploicin的化学结构不一致，但与caloploicin的结构相似。然而，化合物3与caloploicin标准品的LCMS保留时间差异支持它们的结构不同。对化合物3的NMR数据进行详细检查发现，其A环的NMR特征与化合物1、4和5相似，表明化合物3可能具有类似的A环结构。在这种情况下，B环需要容纳四个取代基：两个氯原子、一个甲氧基和一个甲基。这些取代基之间缺乏NOE相关性表明它们不应相邻。假设B环系统源自orsellinic acid，可以得出化合物3可能的结构，如图6A所示。这种B环取代模式已在某些地衣缩酚酸环醚中报道过，如某些缩酚酸衍生物，详细的NMR数据比较支持图6A中披露的B环系统。化合物3的2D NMR数据没有揭示任何与该暂定结构分配相矛盾的相关性，但由于这种质子缺乏型结构提供的信息非常有限，因此无法强有力地支持所确定结构的有效性。在本研究中，化合物3是最难解析的化合物之一，因为其1H NMR谱图中仅检测到四个单峰信号。为了加速CASE结构的生成过程，在不冒丢失正确结构风险的情况下引入了一些约束条件。对MCD进行了以下编辑：a) 化学位移在141.8到162.0之间的碳原子标记为“ob”（必须与杂原子相连），b) 假设3可能是缩酚酸环醚类化合物，在生成的结构中需要包含−O-C=O片段，c) 引入限制，防止氯原子连接到化学位移在151.3到162.0 ppm之间的碳上（图6B）。

使用严格结构生成算法工作流程，从MCD开始进行CASE分析，执行过程如下：k=1,243,128→（结构过滤）→9394→（去除重复项）→1354，计算时间tg=24分钟。图7中列出的四种排名靠前的CASE结构在生成的候选结构中十分突出。值得注意的是，所有结构都保留了相似的A环，但在B核心的取代模式上有所不同。软件针对三种化学位移预测方法都计算了DP4概率，其中两种方法（DP4_A和DP4_N）将我们手动确定的结构保留为最可能的结构（图7），尽管统计参数不如前两个案例那么明确。然而，令人高兴的是，只有候选结构#1呈现出一种在生物合成上可接受的结构，因为它是唯一一个具有两个与orscinol/β-orcinol型前体相匹配的芳香单元的结构。更具体地说，候选结构#2、#3和#4的结构中，各自在与内酯氧处于间位的位置上都缺少一个氧原子，从生物合成的角度来看，这种缺失很难解释。

为了验证该结构，我们对排名前四的候选结构进行了¹³C和¹H化学位移的DFT计算（见表2和表7S）。根据均方根偏差（RMSD）、最大偏差（max_dev）和相关系数（r）值，结构#1和#2的DFT计算¹³C化学位移与实验值最为接近。另一方面，结构#1和#4的计算¹H化学位移与实验值最为吻合。通过结合¹³C和¹H化学位移的分析，可以得出结构#1是化合物3的正确表示。此外，下面概述的生物合成方面的考量也支持从CASE-DFT结构解析分析中得出的结论，化合物3被确定为isocaloploicin（图6A，表S7）。

通过与我们内部的地衣数据库HLDB对比，从丙酮提取物中初步鉴定出化合物7和化合物9分别被初步鉴定为stictic acid和parietin。通过HR-MS以及与已发表数据的NMR光谱对比，确认了它们的结构。 Parietin在浅黄枝衣中的存在早已为人所知，但据我们所知，stictic acid此前并未在浅黄枝衣中被描述过。最后，化合物8——aurantiamide acetate也被从丙酮提取液中分离出来。其鉴定得益于SMART算法（SMART algorithm），该算法通过其表格化的HSQC数据迅速完成识别，余弦相似度得分高达0.977。这种二肽此前在植物、藻类以及真菌中均有发现，但我们无法判断它是通过哪种共生体进行生物合成的。

缩酚酸环醚是地衣中常见的一类多酚化合物，由两个芳香环通过酯键和醚键连接形成，具有特征性的中央氧杂环戊二酮核心。这两个芳香环可以来源于两种基本单元：orsellinic acid (I) 和/或β-orcinol carboxylic acid (II)（图8）。这两种单芳香单元由真菌的非还原型聚酮合酶（NR-PKS）产生，其区别在于β-orcinol carboxylic acid 在3位含有一个甲基，这需要C-甲基转移酶的作用。

缩酚酸环醚的多样性更可能源于一个共同的前体及其后续修饰，而非直接来自相应的缩酚酸。具体来说：

• 在C-3和C-3'位含有甲基的缩酚酸环醚来源于两个β-orcinol 羧酸单元（2xII），被称为β-orcinol缩酚酸环醚。

• 而orscinol缩酚酸环醚则由两个orsellinic acid单元（2xI）构成。

混合型缩酚酸环醚（同时包含这两种单芳香单元）根据其相对于中央环的取向不同，可分为两个亚型。然而，这些是较为罕见的途径，目前已知仅有四种氯代 depsidones 来自混合系列：

• fulgoicin（来自Teloschistaceae 科的Fulgensia fulgida）

• leoidin（来自Lecanora gangaleoides）

• caloploicin（主要来自不同的Caloplaca和Teloschistes种，也见于其他地衣，如Siphula flavovirens、某些Lecidella种和Brigantiaea leprosa）

• eriodermin（来自Erioderma physcioides）

据目前所知，本文报道的新卤代缩酚酸环醚是自1984年发现eriodermin以来，首次发现具有相同碳骨架的缩酚酸环醚。

无论是含卤还是不含卤，具有β-orcinol A环和orcinol B环的缩酚酸环醚数量非常有限，除eriodermin外仅有六种代表：4-O-demethylnotatic acid、notatic acid、substictic acid、subnorstictic acid、subpsoromic acid和subvirensic acid。同样，已报道的具有orcinol A环和β-orcinol B环的缩酚酸环醚也仅有少数几种：isonotatic acid、norisonotatic acid、menegazziaic acid，以及可能的bailesidone。这些不同连接方式的缩酚酸环醚的化学结构如图S12所示。

前体的聚酮合成酶（PKS）后修饰包括氧化、脱羧、甲基化和氯化。在研究的浅黄枝衣样本中，经过这些PKS后修饰，β-orcinol carboxylic acid II与orsellinic acid I的缩合生成了norflavicansone (1)、flavicansone (2)和isocaloploicin (3)，而norvicanicin (4)、vicanicin (5)和4-O-methylvicanicin (6) 则是β-orcino 型缩酚酸环醚（图9）。共分离出的stictic acid (7)也是一种β-orcinol型缩酚酸环醚，它经历了氧化步骤，而不是脱羧、甲基化和/或氯化。

还有两种可能性需要考虑，一方面是orsellinic acid I 和 β-orsellinic acid II的替代缩合，另一方面是两个orsellinic acid I单元的缩合。Sochting和Frödén曾报告称在浅黄枝衣提取物中检测到caloploicin和isofulgidin（图S13），这对应于上述两种尚未被报道的合成途径。然而，该研究仅基于HPLC-DAD与标准品保留时间的对比，尚未通过NMR分析进行验证，因此这些结论的分析证据支持力度较低。

计算机辅助结构解析 (CASE) 分析使用的是市售的ACD/Structure Elucidator Suite v.2023.1.1。

在进行密度泛函理论 (DFT) 分析之前，使用Spartan 20程序进行构象分析。使用Gaussian16程序进行密度泛函理论计算，并且在mPW1PW91/6-311+G(2d,p)（scrf = acetone）// B3LYP/6-31+G(d,p)理论水平下进行分析。化学位移是根据计算得到的各向同性屏蔽常数计算得出的，使用以下缩放系数：斜率：−1.0491，截距：186.9337。随后，基于密度泛函理论的电子能量对化学位移进行玻尔兹曼平均。

Buevich, A. V.; Elyashberg, M. E. (2016). Synergistic combination of CASE algorithms and DFT chemical shift predictions: a powerful approach for structure elucidation, verification and revision. J. Nat. Prod., 79(12), 3105–3116. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.6b00799