内生真菌桔绿木霉中生物活性山梨霉素类衍生物的发现与研究

本研究从黄连内生真菌桔绿木霉（Trichoderma citrinoviride）中成功分离并鉴定了三种新的山梨霉素类衍生物（sorbicillinoid derivatives），分别命名为citrinsorbicillinol A-C（1–3），以及三种已知化合物，包括trichosorbicillin G（4）、邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，5）和3-(4-甲氧基苯基)丙酸（3-(4-methoxyphenyl) propanoic acid，6）。通过综合光谱数据分析、计算机辅助结构解析（ACD/Structure Elucidator）、核磁共振（NMR）谱的密度泛函理论（DFT）计算以及电子圆二色谱（ECD）分析，我们全面阐明了这些化合物的结构特征。

在生物学活性评估中，化合物1–4表现出显著的抗氧化活性。通过1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基清除实验测定，其IC50值范围为27.8至89.6μM。特别值得注意的是，化合物2和3的自由基清除活性与阳性对照抗坏血酸相当，其IC50值分别为27.8和31.2 μM。此外，化合物1在脂多糖（LPS）诱导的RAW 264.7巨噬细胞中展现出潜在的抗炎活性，通过抑制一氧化氮（NO）的生成，其IC50值为52.7μM。

真菌次生代谢产物以其丰富的化学多样性和显著的生物活性备受关注，在药物开发领域具有重要应用价值。值得关注的是，极端环境微生物（如药用植物内生真菌和海洋真菌）往往具有产生结构新颖次生代谢产物的特殊能力。深入探索这些稀有真菌对于发现全新化合物、充分挖掘其应用潜力以及深化对真菌次生代谢产物的理解具有重要意义。

黄连（Coptis chinensis Franch.）的干燥根茎是传统中药"黄连"的主要来源，主要分布于中国重庆、四川和湖北等高海拔地区（海拔1,500–1,800米）。研究表明，其富含生物碱类成分（如小檗碱），具有抗菌、抗肿瘤及抗糖尿病等多种生物活性。独特的山地生态环境和植物内生化学环境，为定殖于黄连的内生真菌创造了特殊的代谢调控条件，使其可能产生结构独特的活性物质。然而，针对黄连内生真菌次生代谢产物的系统性研究仍较为匮乏。

山梨霉素类化合物作为典型的聚酮类代谢产物，其特征性结构包含柔性六元环和可衍生化的山梨基侧链。通过迈克尔加成、狄尔斯-阿尔德反应等后修饰途径，该类化合物可形成高度氧化的多环骨架结构。目前已报道的195种天然山梨霉素类化合物，在抗癌、抗氧化及抗菌等领域展现出多样的生物活性特征。

本研究通过对重庆石柱地区栽培的五年生黄连根茎进行内生真菌分离，获得一株桔绿木霉（Trichoderma citrinoviride）。采用大米固态发酵技术，从该菌株中成功分离获得三类新型山梨霉素衍生物——citrinsorbicillinol A-C（1–3），同时鉴定了trichosorbicillin G（4）、邻苯二甲酸二丁酯（5）和3-(4-甲氧基苯基)丙酸（6）三种已知化合物。本文系统报道了这些化合物的分离纯化、结构表征及生物活性评价工作。

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Citrinsorbicillinol A的结构解析

Citrinsorbicillinol A（1）以黄色无定形粉末形式获得，经HPLC分析显示其纯度超过95%（见补充材料图S26）。通过高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）分析，确定其分子式为C₁₂H₁₂O₅（实测m/z 237.0799 [M+H]⁺，理论计算值237.0763，C₁₂H₁₃O₅⁺），不饱和度为7（补充材料图S5）。¹H NMR谱（补充材料图S1及表1）显示存在11个质子信号，包括两个单峰甲基（δH 1.83和3.92）、四个共轭二烯结构中的烯烃质子（δH 6.25，d，J=15.0 Hz；6.72，d，J=15.0 Hz；7.11，dd，J= 15.0, 11.4 Hz；7.25，dd，J= 15.0, 11.4 Hz）以及一个单峰芳香质子（δH 6.80）。¹³C NMR谱（补充材料图S2及表1）共检出12个碳信号，结合HSQC数据（补充材料图S3），归属为两个甲基（δC 9.4和57.3）、五个sp²次甲基（δC 99.5、128.2、129.6、131.9和141.5）及五个非质子化碳原子（δC 102.8、156.0、163.6、165.9和168.0）。

表1 化合物1–3的¹H NMR (400 MHz) 和 ¹³C NMR (100 MHz) 光谱数据

通过系统解析2D NMR数据（图1A），揭示了化合物1的关键结构特征。HMBC相关信号（补充材料图S4）显示：H-9与C-10及C-7相关，H-8与C-6、C-7、C-9和C-10相关，H-6与C-7及C-8相关，结合质子偶合常数（J=15.0 Hz），证实了(E)-戊-2,4-二烯酸结构单元的存在。此外，HMBC相关网络表明：H3-2-Me与C-1、C-2及C-3相关，H3-3-OMe与C-3相关，H-4与C-2、C-3、C-5及C-6相关，H-6与C-4及C-5相关。结合C-5的特征化学位移（δC 156.0），推断(E)-3-甲氧基-2-甲基戊-2,4-二烯酸部分通过C-5的氧化烯烃碳与(E)-戊-2,4-二烯酸单元相连。进一步分析C-1（δC 163.6）和C-5的化学位移，并结合不饱和度计算，确定C-1与C-5之间形成内酯环，从而构建了不饱和六元内酯环骨架（图1A）。

图1 (A) 化合物1的关键HMBC相关信号。(B) 结构#1的实验与计算¹³C NMR化学位移的回归分析

为验证结构，采用计算机辅助结构解析（CASE）技术。通过ACD/Structure Elucidator（ACD/SE）系统，基于分子式及NMR数据自动生成分子连接图（MCD，图2）。图中以颜色标注原子杂化状态（sp³：蓝色，sp²：紫色，未定义：黑色），并以绿色线标记HMBC相关，紫色线标注nJHH/nJCH（n > 3）远程耦合。利用HOSE、增量法及神经网络三种经验算法预测候选结构的¹H/¹³C化学位移，剔除平均碳偏差＞4 ppm或最大偏差＞20 ppm的结构后，剩余候选结构按¹³C化学位移平均偏差（d_A）排序。最终从41,537个初始结构中筛选出六个候选结构（图3），其中结构#1（dA = 1.605，dN = 1.824，dI = 1.697）与实验数据匹配度最高。

为验证化合物的结构，本研究采用计算机辅助结构解析（Computer-Assisted Structure Elucidation, CASE）技术，通过ACD/Structure Elucidator（简称ACD/SE）系统进行深入分析。基于分子式及核磁共振（NMR）数据，系统自动生成了分子连接图（MCD，图2）。在MCD中，原子杂化状态以不同的颜色标注区分：sp³ 杂化为蓝色，sp² 杂化为紫色，未定义的杂化状态为黑色。同时，图中以绿色线标记HMBC相关信号，紫色线标注ⁿJ_HH和ⁿJ_CH（n > 3）远程耦合，以清晰展示分子内各原子间的连接关系。

图2 化合物1的分子连接图（MCD）

为筛选最优结构，本研究采用HOSE算法、增量法及神经网络算法三种经验算法，对候选结构的¹H和¹³C化学位移进行预测。通过设置筛选条件，剔除¹³C NMR化学位移平均偏差大于4 ppm或最大偏差超过20 ppm的结构后，剩余候选结构按其¹³C NMR化学位移平均偏差（d_A）进行排序。从41,537个初始结构中，最终筛选出六个最可能的候选结构（图3）。其中，结构#1（d_A= 1.605，d_N = 1.824，d_I= 1.697）与实验数据表现出最高的匹配度，进一步验证了其作为目标化合物的可靠性。

图3 ACD/SE输出文件中生成的六个候选结构

进一步通过GIAO方法进行¹³C NMR计算验证（图1B）。在mPW1PW91/6–311 + G(2d,p)水平下计算核磁屏蔽常数，几何结构经B3LYP/6-31G(d)优化（溶剂：氯仿）。线性回归分析表明，计算值与实验值之间的相关系数（R²）达0.9990，平均绝对误差（MAE）为1.53 ppm，确证了结构#1的正确性（图4）。

图4. 化合物1-6的结构式

Citrinsorbicillinol B的结构解析

Citrinsorbicillinol B（2）以黄色油状物形式分离获得，经HPLC分析显示其纯度超过95%（见补充材料图S27）。通过高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）分析，确定其分子式为C₁₆H₂₂O₄（实测m/z 301.1415 [M + Na]⁺，理论计算值301.1416，C₁₆H₂₂O₄Na），不饱和度为6（补充材料图S13）。¹H NMR谱（补充材料图S8及表1）显示存在15个质子信号，包括两个单峰甲基（δH 2.13和2.21）、一个双峰甲基（δH 1.66，d，J = 4.9 Hz）、两个烯烃质子（δH 5.50和5.45）、一个芳香质子（δH 7.36，s）以及一个羟基质子（δH 12.73，s）。¹³C NMR谱（补充材料图S9及表1）共检出16个碳信号，结合HSQC数据（补充材料图S10），归属为三个甲基（δC 7.4、15.6和17.9）、三个sp³亚甲基（δC 28.7、36.4和44.3）、三个sp²次甲基（δC 125.6、129.2和130.6）、一个sp³次甲基（δC 67.4）及六个非质子化碳原子（δC 110.5、113.3、114.9、159.2、161.6和204.4）。

图5 化合物2和3的关键HMBC相关信号

通过系统解析2D NMR数据（图5），揭示了化合物2的关键结构特征。¹H-¹H COSY相关网络（补充材料图S12）显示H3-14/H-13/H-12/H2-11/H2-10/H-9/H2-8之间存在连续耦合，结合HMBC相关信号（补充材料图S11）：H3-14与C-12及C-13相关，H2-10与C-11、C-12、C-8及C-9相关，H2-8与C-7、C-9及C-10相关，证实了(E)-3-羟基壬-6-烯-1-酮结构单元的存在。此外，HMBC相关网络表明：H3-3-Me与C-2、C-3及C-4相关，H3-5-Me与C-4、C-5及C-6相关，H-2与C-1及C-6相关，OH-6与C-1、C-5及C-6相关。进一步分析H-2与C-7的HMBC相关信号，确定(E)-3-羟基壬-6-烯-1-酮部分通过C-7与2,4-二甲基苯-1,3-二醇部分在C-1处以C-C单键连接，从而构建了化合物2的平面结构（图4）。

为确定化合物2的绝对构型，采用时间依赖密度泛函理论（TDDFT）计算其ECD光谱（Gaussian 16程序）。计算结果表明，9R构型的ECD光谱与实验光谱高度一致（图6），因此化合物2的绝对构型被确定为9R（图4）。

图6 化合物2的实验与计算ECD光谱

Citrinsorbicillinol C的结构解析

Citrinsorbicillinol C（3）以黄色粉末形式分离获得，经HPLC分析显示其纯度超过95%（见补充材料图S28）。通过高分辨电喷雾电离质谱（HREIMS）分析，确定其分子式为C₁₂H₁₆O₄（补充材料图S21），表明其比化合物2少一个C₄H₆单元。结合详细的NMR光谱分析（补充材料图S17、S18及图4），发现化合物3的化学结构与化合物2高度相似，主要区别在于化合物3缺少两个脂肪族亚甲基和两个烯烃次甲基结构单元。

通过系统解析2D NMR数据（补充材料图S19、S20及图5），进一步确认了化合物3的结构特征。HMBC相关信号表明：H3-3-Me与C-2、C-3及C-4相关，H3-5-Me与C-4、C-5及C-6相关，H3-10与C-8及C-9相关，H2-8与C-1及C-7相关，H-2与C-1及C-7相关，OH-6与C-1、C-5及C-6相关。这些数据支持化合物3的侧链比化合物2少一个正丁烯单元的结构推断。最终，通过比较实验与计算的ECD光谱（图7），确定化合物3的绝对构型为9R。

图7 化合物3的实验与计算ECD光谱

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本研究从黄连（Coptis chinensis）内生真菌桔绿木霉（Trichoderma citrinoviride）中分离并鉴定了三种新的聚酮类化合物1–3以及三种已知化合物4–6。生物活性实验表明，化合物1–4表现出显著的抗氧化活性，特别是在缓解氧化损伤方面具有潜在的应用价值。其中，化合物2和3的自由基清除能力与阳性对照抗坏血酸相当。此外，化合物1通过抑制一氧化氮（NO）生成，表现出潜在的抗炎活性。这些化合物不仅丰富了生物活性天然产物的种类，还为开发新型抗氧化和抗炎剂提供了新的方向。未来的研究应进一步探索这些生物活性的作用机制，并在更复杂的生物系统中评估这些化合物的功效。