从天然产物中挖掘抗癌先导分子：Alstonia scholaris 中的喹啉生物碱

一、研究背景

灯台叶(Alstonia scholaris)作为傣族民间常用中药，具有清热解毒、止咳平喘等作用。近年来，在抗肿瘤、抗炎和抗菌等方面显示出重要的潜在药用价值。基于灯台叶在民间亦用于抗肿瘤组方，研究者对课题组前期富集分离的单萜吲哚生物碱化合物进行抗肿瘤活性筛选，鲜有发现活性显著的细胞毒药理作用。由于单萜吲哚生物碱(monoterpenoid indole alkaloids, MIAs)和单萜喹啉生物碱(monoterpenoid quinoline alkaloids, MQAs)在生源上具有相同生源途径，本实验借助ACD/MS Workbook Suite模块功能对灯台叶总生物碱提取物进行质谱和二级质谱分析，对指认的二级质谱MS/MS含有喹啉母核碎片峰的化合物进行定向分离，确证四种骨架新颖的喹啉生物碱化合物——Alstoschoquinolines A−D（1−4）。活性筛选显示化合物3可通过影响谷胱甘肽稳态发挥抗结肠癌细胞毒作用，表明从富含单萜吲哚生物碱的傣药灯台叶中靶向挖掘的单萜喹啉生物碱化合物有显著的抗结肠癌细胞毒活性。该部分工作由云南大学罗晓东研究员课题组于近期发表于《Journal of Organic Chemistry》，DOI:  10.1021/acs.joc.4c02450。

二、化合物的分离与结构鉴定

1、

ACD/MS Workbook Suite指导化合物分离

通过液相色谱-质谱（LC/MS）检测的直接分离技术，从灯台树(Alstonia scholaris)叶中分离出四种全新喹啉生物碱化合物——Alstoschoquinolines A−D（1−4）。这些化合物代表了三种新颖的化学骨架，其中1和2是含六个连续手性碳的具有5/6/5骈合喹啉骨架的化合物；而化合物3和4则是分别具有6/6/6/6和6/6/8/6四环的新颖桥环骨架化合物（图1）。在生源上，它们可能来自于corynantheine型单萜吲哚生物碱，通过一系列的氧化和重排反应生成。

图1. Alstoschoquinolines A−D (1−4)的结构式

由于单萜吲哚生物碱(monoterpenoid indole alkaloids，MIAs)和单萜喹啉生物碱(monoterpenoid quinoline alkaloids, MQAs)具有类似的生源途径，研究者依据前期建立的单萜吲哚生物碱数据库和分离到的少量喹啉化合物进行排重和二级质谱MS/MS碎片峰指认，借助ACD/MS Workbook Suite模块对灯台叶总生物碱提取物进行质谱和二级质谱MS/MS碎片峰分析，对分子量在(m/z 200.0000-400.0000)的含偶数氮(不含氮)的质谱峰进行二级质谱分析，对确证二级质谱MS/MS含有喹啉母核碎片峰化合物进行定向分离。结果表明化合物1 (m/z= 355.1656)经MS/MS碎片峰识别，指认含有m/z=130.0653的喹啉碎片及其碎片群；化合物3 (m/z= 279.1490)经MS/MS碎片峰识别，表明含有m/z=128.0487的喹啉碎片及其碎片群；化合物4 (m/z= 279.1479)经MS/MS碎片峰识别，表明含有m/z=130.0636的喹啉碎片及其碎片群（图2-图9）。以化合物1−4为例，具体MS/MS碎片峰指认如下：

图3. 借用ACD/MS Workbook Suite模块指认化合物1的MS/MS喹啉碎片峰 (m/z=130.0653)

图5. 借用ACD/MS Workbook Suite模块指认化合物2的喹啉碎片峰 (m/z=130.0642)

研究者将LC-MS指导下分离的化合物1-4的1D和2D NMR谱图信息以及质谱数据导入ACD/Structure Elucidator程序。程序根据这些数据，结合经验光谱数据和特征偶合常数，自动创建了分子连接图（MCD，图10）。基于核磁数据经验，当碳谱化学位移值大于100时，碳原子设定为sp²杂化状态；当碳谱化学偏移值小于90时，碳原子被设定为sp³杂化状态；当化学偏移值大于170时，若有必要则将碳原子设定为羰基碳。同时连接1个苯环，以便减少计算时间（图11）。在计算过程中，程序还实施了光谱内部过滤，丢弃平均碳偏差大于3ppm或最大碳偏差大于15ppm的结构。以化合物1为例，经过这些筛选条件后，最终确定了1个结构（No.2，ID:10）具有较低的d_A、d_N和d_I值，且没有不合理的二维相关性，如绿色单箭头和蓝色双箭头所示的不合理相关，从而确定该结构为化合物1的正确结构（图12）。

图11. 编辑后的化合物 1 的分子连接图（MCD）

图12. ACD/Structure Elucidator  生成的化合物1的部分候选结构

预测化学位移与实验值对比

对于每个候选结构，ACD/Structure Elucidator使用三种经验方法预测¹³C{¹H}化学位移，并计算实验值与预测值之间的平均偏差（HOSE算法: d_A；神经网络算法: d_N；增量法: d_I）。通常，正确的结构具有平均偏差值d_n小于3ppm，并且在所有候选结构中排名靠前。例如，在化合物3的结构验证中（图13），通过对比实验值和计算值，确定了化合物3的结构（No.1，ID:2），其平均偏差值符合正确结构的特征(d_n<3ppm)。而另一个候选分子（No.2，ID:1）有一个碳原子最大碳偏差d_n大于15ppm(红色标注)，进一步表明其不是正确结构。

程序还能够检测HMBC和¹H-¹H COSY中的非标准相关性（n > 3），并以绿色/红色单箭头和蓝色双箭头分别表示。这些相关性的检测有助于进一步验证结构的合理性。例如，在化合物1的结构分析中(图12)，通过检测到的非标准相关性，进一步确认了其结构的正确性。

在对四种化合物进行抗肿瘤活性测试时，研究者们发现，化合物3在对抗肺癌细胞系H1299、肝癌细胞系MHCC97H以及结肠癌细胞（HCT116和CT-26）时表现出显著的抑制效果，其IC₅₀值分别为8.0、11.2、4.8和5.5 μM。进一步的机制研究揭示，化合物3通过干扰谷胱甘肽（GSH）循环，破坏氧化还原稳态，从而触发活性氧（ROS）凋亡。具体来说，化合物3显著增加了ROS⁺细胞的百分比，降低了线粒体膜电位（MMP），并显著提高了caspase-3/7的活性，这些数据表明化合物3通过内在途径诱导结肠癌细胞凋亡。此外，通过添加GSH（100 μM）可以部分恢复由化合物3引起的ROS诱导凋亡，进一步证实了其通过干扰GSH再生诱导细胞凋亡的机制（图14）。

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